ДИАХИМ-ЦИТОСТЕЙН-НЭ Определение неспецифической эстеразы в лейкоцитах

Важная информация

1. Неспецифические эстеразы — это ферменты, которые быстро деградируют при контакте с внешней средой, поэтому для достоверности результата необходима моментальная фиксация мазка в спирт-формалиновой смеси (1 часть 40%-ного раствора формалина и 9 частей спирта (метилового (100%) или этилового (96%)).

2. Чистота используемой посуды играет важную роль при проведении цитохимических реакций, поэтому рекомендовано использовать для каждой методики свой отдельный набор посуды.

3.Для успешного проведения цитохимических реакций необходимо после фиксации полностью высушить мазок, можно под вентилятором. Сухой на вид мазок осторожно промокнуть сухой чистой фильтровальной бумагой, чтобы гарантированно удалить пары воды.

ИНСТРУКЦИЯ

ПОДГОТОВКА К АНАЛИЗУ:

Приготовление мазков крови и костного мозга:

2-3 мазка крови (или костного мозга) сделать на предметных стеклах с помощью более узкого предметного шлифованного стекла следующим образом. На сухое предметное стекло, ближе к короткой стороне наносят пипеткой небольшую каплю крови. Предметное стекло следует держать на столе или в левой руке за узкие края. Правой рукой приставить шлифованное стекло узким краем к стеклу с кровью слева от капли под углом 45° и продвинуть его вправо до соприкосновения с каплей крови. Выждать до тех пор, пока кровь расплывется по всему ребру шлифованного стекла, и затем легким быстрым движением провести его справа налево до тех пор, пока не будет исчерпана вся капля. Капля крови должна быть небольшой и соразмерна так, чтобы весь мазок помещался на стекле, не доходя 1 - 1,5 см до его края. Нельзя сильно нажимать на стекло, так как многие клетки крови могут оказаться поврежденными. Хорошо сделанный мазок тонок, имеет желтоватый цвет и оканчивается “метелочкой”.

После приготовления мазки следует быстро высушить на воздухе до исчезновения влажного блеска. При медленном высыхании может изменяться морфология клеток крови.

Приготовление маточного раствора: содержимое флакона реагента 1 растворить в реагенте 5 и 2,5 мл дистиллированной воды. Хранить в холодильнике. Раствор стабилен в течение 3 месяцев.

Рабочий раствор: готовить непосредственно перед началом окраски. В 25 мл дистиллированной воды растворить 0,5 мл маточного раствора из холодильника. Добавить 2,5 мл реагента 3 и содержимое флакона реагента 2. Смешать.

Разделить рабочий раствор на две равные части. В одну часть добавить содержимое флакона реагента 4 для подавления реакции.

Готовый раствор использовать в течение 15 минут!

Цитохимическую реакцию и ее подавление проводить одновременно в одинаковых условиях.

ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА:

Результаты окраски:

Примечание: цитохимические исследования проводят в мазках крови, костного мозга, лейкоконцентрата, спинномозговой жидкости, аспиратах лимфоузлов, селезёнки, лейкозных инфильтратах разной локализации. Мазки крови и костного мозга лучше делать непосредственно из материала, полученного без добавления антикоагулянтов. При выраженной лейкопении цитохимические исследования целесообразно проводить в препаратах, полученных из лейкоконцентрата венозной крови. Используются только свежие нативные сухие препараты, которые должны сохнуть на воздухе не менее 30 минут. Препараты фиксируют сразу после высушивания на воздухе. Зафиксированные мазки могут храниться в темноте при комнатной температуре в течение трёх дней.

Оценка результатов цитохимических реакций.

При цитохимических реакциях необходимо определить характер цитохимических реакций – слабая, умеренная, интенсивная, с указанием процента положительно реагирующих клеток.

С этой целью применяют полуколичественный метод оценки результатов в условных единицах или вычислением среднего цитохимического коэффициента (СЦК). Принцип его заключается в оценке интенсивности окраски и числа положительных гранул при анализе 100 клеток:

0- отсутствие окраски цитоплазмы расценивается как отрицательная реакция;
+ - слабодиффузное окрашивание или единичные гранулы в цитоплазме;
++ - диффузная окраска цитоплазмы, наличие умеренного числа гранул;
+++ - интенсивное окрашивание цитоплазмы, многочисленные гранулы, заполняющие всю клетку.

После оценки интенсивности окраски цитохимической реакции проводят расчет результатов в условных единицах или СЦК.

Вычисление среднего цитохимического коэффициента по формуле Astaldi и Verga: 3хС+2хВ+А

Оценка результатов в условных единицах по методике Karlow:
СЦК = (3хС+2хВ+А) / 100, где
А – количество клеток со слабоположительной реакцией;
В – количество клеток с умеренно положительной реакцией;
С – количество клеток с резко выраженной реакцией.

При этом показатель активности реакций в условных единицах может колебаться от 0 до 300, а СЦК – от 0 до 3%