Использование цитохимических исследований в лабораторной практике

М.Н. Зенина

ассистент кафедры клинической

лабораторной диагностики МАПО,

г. Санкт-Петербург

Цитохимия, как направление гистохимии, изучает химическую природу клеточных структур, распределение химических соединений внутри клетки и их превращения в связи с функцией клетки и ее отдельных компонентов [4]. Основоположником гистохимии считают французского фармацевта, ботаника и микроскописта Франсуа Винсента Распайля (1794–1878 гг.), открывшего многие гистохимические реакции, которые не потеряли своей актульности и сегодня. Однако прошло более ста лет, прежде чем цитохимические исследования начали проводиться систематически и продуктивно. Существенным прогрессом в этой области явилось применение анилиновых красителей (конец XIX – начало XX вв.). Цитохимические методы (определение активности миелопероксидазы, окраска липидов суданом черным В) в гематологии эмпирически начали применяться в первой четверти XX в. Теоретические основы диагностической цитохимии гемобластозов заложены значительно позже – в исследованиях И.Ф. Сейца и И.С. Лугановой, основные результаты их исследований отражены в монографии “Биохимия клеток крови и костного мозга в норме и при лейкозах”. Эти ученые впервые показали существование фундаментальных химических и метаболических отличий различных по степени зрелости трансформированных клеток миелоидного и лимфоидного происхождения при хронических лейкозах. Систематическое изучение цитохимических особенностей наименее дифференцированных бластных клеток проведено Hayhoe с соавт. и отечественными гемоцитологами Э.И. Терентьевой, Л.И. Казановой, В.Т. Морозовой, В.Б. Лецким, И.С. Петерсон, Р.В. Ленской [2]. Современная цитохимия основана на химических цветных реакциях, выявляющих в клетках специфические вещества и ферменты. Лейкозные клетки сохраняют свойства своих нормальных аналогов; выявление этих свойств и, благодаря этому, принадлежности лейкозных бластов к определенному клеточному типу, способствует установлению формы острого лейкоза, что необходимо для проведения адекватной и эффективной терапии. Международный совет по стандартизации в гематологии (International Council for Standardization in Haematology – ICSH) рекомендовал для диагностики острых лейкозов исследование диагностически значимых ферментов:

~ миелопероксидаза;

~ неспецифические эстеразы (α-нафтилацетат-эстераза), кислая неспецифическая эстераза, хлорацетатэстераза (нафтол-AS-D- хлорацетат-эстераза);

~ кислая и щелочная фосфатазы;

и субстанций:

~ липиды (СЧ);

~ гликоген (PAS-реакция) [7].

Цитохимические методы просты в исполнении, информативны и не требуют использования сложной аппаратуры. В настоящее время фирмой ”АБРИС+” выпускаются готовые цитохимические наборы, позволяющие быстро воспроизвести методику и оценить полученные результаты.

Приготовление мазков

Для цитохимических исследований мазки готовят непосредственно из аспирационного материала (костного мозга, периферической крови, лимфатического узла) без добавления антикоагулянта. Если нельзя соблюсти эти условия из-за быстрой сворачиваемости, материал помещают в антикоагулянт (ЭДТА, оксалат, цитрат, гепарин). Предпочтение отдается гепарину, вызывающему наименьшие морфологические изменения лейкоцитов [1]. Оптимальные режимы фиксации, необходимые для сохранения структурных компонентов клеток и закрепления исследуемых веществ в местах прижизненного их расположения, приведены в инструкциях к применению цитохимических наборов.

Количественная оценка

Полученные результаты оцениваются полуколичественным методом, с вычислением среднего цитохимического коэффициента (СЦК). Приступая к микроскопии, в каждом отдельном мазке при обзорном просмотре выбирают эталоны – клетки, содержащие исследуемое вещество. Отсутствие окраски цитоплазмы принимается за нулевую степень. Наличие в цитоплазме небольшого окрашенного участка, составляющего 1/4 часть всей цитоплазмы, соответствует интенсивности реакции 1-й степени (А). Окрашивание 8/10 цитоплазмы принимается за 2-ю степень насыщения (В). При 3-й степени интенсивности реакции исследуемое вещество заполняет всю цитоплазму и даже выявляется на ядре. Затем, как при подсчете лейкоцитарной формулы, в разных участках мазка подсчитывают, не пропуская, 100 однотипных клеток и рассчитывают процентное содержание клеточных элементов с различной интенсивностью реакции.

Показатель активности в условных единицах вычисляется по формуле (Astаldi,Verga, 1975 г.):

3С + 2В + А.

Средний цитохимический коэффициент (СЦК) вычисляется по формуле

(по Kaplow):

СЦК = 3С+2В+А

100

При вычислении показателя активности, клетки с интенсивностью 0 исключаются; к проценту клеток с интенсивностью 1 (А) прибавляется процент клеток с интенсивностью 2 (В), умноженный на коэффициент 2 и количество клеток с интенсивностью 3 (С), умноженное на коэффициент 3. Показатель активности в условных единицах от 0 до 300, СЦК 0–3% [5].

Ферменты

Миелопероксидаза

Принцип цитохимического метода определения миелопероксидазы основан на окислении бензидина в присутствии перекиси водорода в окрашенное нерастворимое соединение желтого цвета. Фермент определяется в 100% нейтрофилов и эозинофилов. При этом миелопероксидаза стабильно сохраняет свою высокую активность при выходе клеток из костного мозга. В моноцитах активность фермента проявляется почти во всех клетках, но интенсивность реакции невысока по сравнению с нейтрофилами. В лимфоцитах, плазмоцитах и клетках красного ряда активность миелопероксидазы не выявляется.

Определение миелопероксидазы в лейкоцитах возможно с помощью набора ДИАХИМ-ЦИТОСТЕЙН-МПО.

Неспецифические эстеразы

В группу ферментов, гидролизирующих эфиры карбоновых кислот, входят неспецифические эстеразы. Для определения локализации этих ферментов пользуются методом азосочетания. Метод основан на том, что азокраситель, образующийся при сочетании освобождающихся при гидролизе α-нафтола с различными стабилизированными диазотатами, быстро осаждается в месте локализации фермента в нейтральной среде. Наиболее изученные эстеразы – это хлорацетатэстераза (нафтол-AS-D-хлорацетат-эстераза) и α-нафтилацетат-эстераза.

Хлорацетатэстераза отличается избирательностью ее выявления в клетках гранулоцитарного ряда и в части моноцитов. Максимум активности фермент достигает в промиелоцитах. Выявляется в виде темно-фиолетовых гранул, локализованных в цитоплазме. В лимфоидных и плазматических клетках, в эозинофилах активность хлорацетатэстеразы не выявляется.

Определение хлорацетатэстеразы в лейкоцитах возможно с помощью набора

ДИАХИМ-ЦИТОСТЕЙН-ХЭ.

α-нафтилацетат-эстераза наибольшей активности достигает в промиелоцитах, по мере созревания клеток активность этого фермента падает. Наибольшую активность α-нафтилацетат-эстеразы имеют моноциты крови и костного мозга. Характерной особенностью этой реакции в моноцитах является почти полное ее подавление ингибитором – фтористым натрием. В лимфоцитах активность α-нафтилацетатэстеразы невысока (1–5 гранул в клетке).

Определение α-нафтилацетат-эстеразы в лейкоцитах возможно с помощью

набора ДИАХИМ-ЦИТОСТЕЙН-НЭ.

Щелочная фосфатаза – гидролитический фермент с оптимумом действия при рН 9,2–9,6. Метод определения основан на ферментативном гидролизе нафтилфосфата натрия и реакции освобождающегося нафтола с солью диазония. При этом в участке фосфатазной активности образуется осадок синтезированного азокрасителя. Фермент содержится преимущественно в нейтрофильных лейкоцитах.

Определения щелочной фосфатазы в лейкоцитах возможно с помощью на-

бора ДИАХИМ-ЦИТОСТЕЙН-ЩФ.

Кислая фосфатаза является гидролитическим ферментом с оптимумом действия при рН 5,0. Кислая фосфатаза содержится во всех клетках крови. Для клеток миелоидной направленности дифференцировки характерно диффузное окрашивание, при этом наименьшая активность обнаруживается в зрелых нейтрофилах. Наибольшей активностью обладают эозинофилы и моноциты. Значительное диффузное окрашивание выявляется в мегакариоцитах и плазматических клетках. Гранулярное окрашивание – в лимфоцитах и ядерных клетках красного ряда.

Определение кислой фосфатазы в лейкоцитах возможно с помощью набора

ДИАХИМ-ЦИТОСТЕЙН-КФ.

Гликоген

Наличие гликогена в клетке определяют с помощью ПАС- или ШИК-реакции (шифф-йодная кислота) – окисление гликогена йодной кислотой до диальдегидов, которые, взаимодействуя с реактивом Шиффа, образуют нерастворимый продукт красного цвета. Гликоген наблюдается во всех морфологически идентифицируемых миелоидных клетках в виде мелких гранул, расположенных плотно в цитоплазме и на поверхности ядер. Лимфоциты содержат меньше гликогена, чем гранулоциты, но в их цитоплазме часто выявляют ПАС-положительные гранулы. Они могут быть разной величины и их число значительно варьирует.

Определение гликогена в лейкоцитах возможно с помощью набора ДИАХИМ-

ЦИТОСТЕЙН-ПАС.

Для полуколичественной оценки содержания гликогена в клетках используются следующие градации:

0 – в цитоплазме нет материала;

+ – рассеянные гранулы, или “венчик” из 1 ряда гранул;

++ – венчик из 2 рядов гранул;

+++ – венчик из 3 и более рядов гранул или блоков.

Оценивают 100 клеток, сумма дает итог от 0 до 300.

Липиды локализуются в цитоплазме клеток и обнаруживаются преимущественно в нейтрофильных гранулоцитах, для выявления которых пользуются суданом черным В. Выявление липидов основано на способности красящих веществ растворяться в жирах.

Определение липидов в лейкоцитах с помощью судана черного В возможно

с помощью набора ДИАХИМ-ЦИТОСТЕЙН-СЧ.

Современные цитохимические методы исследований применяются в онкогематологии в комплексе с морфологической оценкой клеточных элементов крови, костного мозга, лимфатических узлов. Различные клеточные линии в цитохимических реакциях демонстрируют неодинаковый характер окраски. Таким образом, цитохимический маркер дает возможность выявить направленность дифференцировки кроветворных клеток. Использование вышеназванных цитохимических методов в большинстве случаев бывает достаточным для выявления линейной принадлежности опухолевых клеток и определения варианта острого лейкоза.

При определении активности миелопероксидазы интенсивная положительная реакция наблюдается в миелобластах, слабая или отрицательная — в монобластах, лимфобласты остаются неокрашенными. При окрашивании бластных клеток суданом черным В получают данные, дополняющие результаты определения активности миелопероксидазы. Положительная реакция при выявлении активности хлорацетатэстеразы отмечается только в миелобластах. Реакция на неспецифическую эстеразу является маркерной для монобластов и более зрелых клеток моноцитарно/макрофагального ряда. Обнаружение гликогена в виде крупных гранул или блоков в цитоплазме характерно для бластов лимфоидного происхождения. Определение кислой фосфатазы в виде крупной гранулы или пятна в одном участке цитоплазмы позволяет при остром лимфобластном лейкозе отличить бласты Т-клеточной природы от лейкемических клеток, возникающих из В-клеток-предшественников.

При диагностике хронических миелопролиферативных заболеваний немаловажное значение имеет определение активности щелочной фосфатазы при сублейкемическом миелофиброзе, идиопатической полицитемии, бластном кризе хронического миелолейкоза и низкой активности фермента, вплоть до отрицательной реакции, при хроническом миелолейкозе [6]. В некоторых случаях цитохимические реакции позволяют определить принадлежность клеток к опухолевому клону (определение тартратрезистентной кислой фосфатазы при волосато-клеточном лейкозе).

Результаты цитохимических исследований клеток крови при острых лейкозах легли в основу их классификации и способствовали внедрению в практику методов дифференцированной терапии [3].

Список использованной литературы

1. Бутенко З.А., Глузман Д.Ф., Зак К.П. Цитохимия и электронная микроскопия

клеток крови и кроветворных органов. Киев: Изд. “Наукова думка”, 1974.

2. Глузман Д.Ф., Скляренко, Л.М., Надгорная В.А. Диагностика опухолевых забо-

леваний кроветворной и лимфоидной тканей // Здоровье Украины. 2004. № 94.

С. 1–3.

3. Морозова В.Т. Лабораторная диагностика лейкозов. Л.: Медицина, 1977.

С. 152.

4. Пирс Э. Гистохимия теоретическая и прикладная. М.: Издательство иностран-

ной литературы, 1962. С. 962.

5. Хейхоу Ф.Г.Дж., Кваглино Д. Гематологическая цитохимия. М.: Медицина, 1983.

С. 320.

6. Цитохимическая диагностика в лабораторной гематологии: Методическое

руководство. Атлас. СПб., 2003. С. 38.

7. Scott C.S., Zen Ottolender J.Y., Swirscky D. et al. Recommended procedures for the

classificasion of acute Leukamies // Leukemia and Lymphoma. 1993. V 11. Р. 37–500.

Статья напечатана в журнале справочник заведующего КДЛ №4 опрель 2009 г.

ОПРОС

  1. Уважаемые посетители нашего сайта, кем Вы являетесь?

Возврат к списку


ВОПРОСЫ-ОТВЕТЫ

Вопрос:
Можно ли ваш набор для окраски по Циль-Нильсену использовать в патанатомии?

Подробнее

ПОЛЕЗНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Адаптация красителей и наборов ООО НПФ «АБРИС+»

Адаптация красителей и наборов ООО НПФ «АБРИС+» на автоматические окрасчики мазков, такие как "Юни-Стейн-Авто" ("ЭмкоСтейнер"), "V-Chromer", "АвтоОМК-01", "HemaT" и другие.

Читать далее

ОТЗЫВЫ

Отзыв СПБ ГУЗ № 107:

Отзыв СПБ ГУЗ № 107 по набору Диахим ПАП и прибору АФОМК.

Читать далее


НАШИ ПАРТНЕРЫ:

Войти в систему